R&E FOR YOU(vol.7) - 내생균근 분포 패턴 분석을 통한 식물 생장 환경 분석 연구

연구 주제 선정

우리 연구팀이 3월, 연구 주제를 선정할 때 처음 떠올렸던 아이디어는 '마약 제조와 같은 약물 관련 범죄가 있었던 장소에 만약 흙이 있었다면 그 흙의 성분을 분석해 수사할 수 있지 않을까?'라는 아이디어였습니다. 다만 이 아이디어는 실현성이 떨어진다고 판단하여 아이디어를 폐기하였으나, 이 아이디어에서 '흙에 의해 그 흙에 심겨 있는 식물이 영향을 받는다'라는 개념에 접근하게 되었습니다. 이후 저희는 자료 조사를 통해 흙에 사는 곰팡이가 심어진 식물에 영향을 준다는 사실을 알아냈습니다. 저희는 이를 이용하여 흙에 사는 곰팡이가 심어진 식물에 어떠한 영향을 주는지를 자세히 알아보기 위해 CNN 모델을 사용하여 분석하려 시도했습니다. 따라서 저희가 선정한 주제는 '근권 주변 근균의 포자 분포 패턴 분석을 통한 식물 군집 생장 적합도 측정 CNN 모델 구축'으로 선정하였습니다. 다만 CNN 모델 구축이 꼭 필요한 작업이라고 판단되지 않아 최종적으로 주제를 '내생균근 분포 패턴 분석을 통한 식물 생장 환경 분석 연구'로 정했습니다.

연구를 시작하기 전...

연구를 시작하기에 앞서 각자 선행연구 논문과 내생균근에 대한 자료들을 조사하여 조사한 자료를 각자 공유하는 시간을 가졌습니다. 내생균근이라는 주제에 대해 서로가 생소한 개념이었기 때문에 자료 조사와 분석을 하는 데 제법 오랜 시간이 걸렸는데, 각자의 흥미 분야에 따라 다른 자료를 분석하여서 실험 과정에서 생긴 문제들을 해결하는데 다양한 방향에서 해결 방안을 제시하는 데 도움이 되었습니다. 또한, 실험 과정에서 SEM-EDS, SEM, 분광광도계, 위상차현미경, ICP(유도결합플라즈마)분석법 등의 실험 중 필요한 기기들의 사용 방법을 배웠고, 토양에 있는 내생균근의 유무를 조절하여 옥수수를 배양해 보는 예비 실험을 하면서 연구의 방향성을 조절하였습니다. 내생균근이 있는 토양과 내생균근이 없는 토양에서 옥수수의 생장을 비교하기 위해 학교 인근 나무 주변에서 대량의 흙을 채취한 후, 원 상태 그대로의 흙을 실험군, 고압증기멸균기를 이용해 내생균근을 제거한 흙을 대조군으로 사용하였습니다. 그러나 토양의 내생균근의 유무에 따른 옥수수의 생장 정도가 유효한 결과가 나타나지 않았기에 토양에 있는 내생균근을 배양하기보다는 이미 내생균근과의 공생관계가 나타난 개체를 선정하여 내생균근을 관측하는 방향으로 연구를 진행하기로 하고 본격적인 연구를 시작하였습니다.

연구 과정: 수많은 실패

예비 실험에서의 결론을 바탕으로 저희 SA팀은 갈대 서식 토양, 텃밭 토양, 잔디 토양, 수목 서식 토양, 갯벌 일원, 청량산 일원, 인천대공원 일원, 계양산 일원, 학교 텃밭, 황무지 일원과 같이 다양한 지역에서 유기물 함량이 다른 다양한 토양 및 식물의 뿌리를 샘플링하였습니다. 식물 뿌리에 공생하는 내생균근을 실체 현미경을 통해 관찰 및 분석하였고, 채집한 토양은 밥과 함께 Growth Chamber에 넣어 균근을 배양시킨 후 배양된 균근을 실체현미경을 통해 분석하였습니다. 또한, 토양 중 옥수수와 갈대의 토양은 SEM-EDS를 사용하여 토양 내부의 인과 질소의 양을 분석하였습니다.

하지만 결과가 생각처럼 잘 나오지는 않았습니다. 실체 현미경을 통한 식물의 뿌리 관측에서는 식물의 뿌리에서 균사와 비슷한 구조물을 관찰할 수 있었으나 뿌리털과의 구분이 명확하지 않았습니다. 그러나 토양 샘플의 분석 과정에서 지역별로 밥에 배양된 균류의 실체현미경 사진에서 지역별로 명확한 차이가 없었고, SEM-EDS 분석에서는 토양에서의 인과 질소 자체가 검출이 안 되는 문제점이 있었습니다.

이후, 인, 질소 분석에서의 문제점을 해결하기 위해 다른 방법을 사용해 보았지만 큰 효과가 없었습니다. 저희는 미량의 인과 질소를 측정하기 위해 pH에 따라 색이 변하는 지시약을 사용하여 토양 속의 인과 질소의 대략적인 함량을 측정하였습니다. 질산이온을 아질산 이온으로 환원시키기 위해 분말 금속 아연을 사용하고, 술포닐 아미드 및 나프틸렌디아민과 반응시켜 얻어진 착색의 흡광도로부터 질산산화물의 농도를 확인하였습니다. 또한, 토양 속의 인 화합물을 인산염(PO₄) 형태로 변환한 후 인산이온이 몰리브덴산암모늄과 반응하여 생성된 몰리브덴산인 암모늄을 염화제일주석으로 환원하여 생성된 몰르브덴 청색의 진하기로 인의 농도를 확인하였습니다. 그러나 이 또한 양이 매우 적어 시료별 색 변화가 크지 않아 육안으로 비교가 쉽지 않았습니다.

연구 과정: 피드백 및 개선

이런 상황에서 STEAM ACTIVITY Colloquium을 통해 인천대학교 생명공학부 최재혁 부교수님께서 뿌리에서 균사와 뿌리털을 구분하기 위해 내생균근 특이적인 염색이 필요하고, 밥에서 배양된 균류는 Growth Chamber 내에서 감염되었을 수 있으며, 내생균근을 직접 배양하기는 쉽지 않으니 내생균근과의 공생 관계를 형성한 식물 개체를 통해 내생균근을 얻는 방법을 고려해 보라고 조언해 주셨습니다. 이러한 조언을 바탕으로 저희는 내생균근을 염색시킬 수 있는 CBE 용액을 사용해 뿌리를 염색시켰습니다. 이를 통해 저희는 내생균근을 확실하게 관찰할 수 있었을 뿐만 아니라, 뿌리의 염색 비율을 통해 내생균근을 정량화하는 방법인 눈금선 교차법을 이용해 내생균근을 정량화할 수 있었습니다. 또 식물 뿌리 주변의 흙을 채취하여 나일론 필터로 거르는 방법을 통해 내생균근 포자를 얻기로 계획했습니다.

이와 동시에 저희 스스로도 선행 연구 조사를 통해 인과 질소의 농도를 측정할 수 있는 새로운 방법을 탐색했고, 연구 계획을 변경하였습니다. 미량의 인과 질소 농도를 측정하기 위해 분광광도계를 사용하기로 계획하였습니다, 또한 토양 환경이 식물 생장에 적합한지에 대해 평가할 기준이 없다는 사실을 인지하고, 식물 주변 토양의 중금속 농도를 그 기준으로 잡기로 했습니다. 중금속 농도는 ICP 분석법을 통해 측정하기로 계획하였습니다.

연구 과정: 다시 시작된 실패와 개선

저희는 변경한 연구 계획에 따라 분광광도계와 ICP를 사용하고자 하였으나 시료 준비 단계에서부터 난관에 봉착했습니다. 분광광도계와 ICP를 이용하기 위해서는 시료의 전처리가 필요했고, 그 전처리의 첫 번째 단계는 시료 파쇄였습니다. 다시 말해, 시료를 곱게 갈아 가루처럼 만들 필요가 있었습니다. 따라서 저희는 시료를 드라이 오븐에서 바싹 말린 후 막자사발을 이용해 파쇄해보았습니다. 그러나 갈대 시료와 같이 질긴 시료들은 막자사발을 이용해 파쇄하는 것이 쉽지 않았습니다. 마땅한 해결 방안이 없어 고민하던 중, 저희는 액체질소를 떠올리게 되었습니다. 액체질소에 장미꽃을 넣었다 빼면 부드럽던 장미꽃이 마치 유리처럼 깨지게 된다는 사실을 떠올리고, 이를 이용해 질긴 시료들을 쉽게 파쇄할 수 있을 것으로 생각했습니다. 막자사발에 액체질소를 부어 시료를 순간적으로 얼린 뒤 빠르게 빻는 방법을 통해 파쇄를 시도했고, 결과는 성공적이었습니다.

중간보고서 발표회

저희 연구팀은 9월, 중간보고서 발표회를 통해 저희 연구에 대한 조언을 얻을 수 있는 두 번째 기회를 받았습니다. 중간발표회를 통해서는 첫 번째로 연구의 전반적인 부분에 대해 조언을 받았습니다. 연구를 완전히 마치지 않은 상태에서 진행한 발표회였기 때문에 중간발표회 시점에서는 '알 수 없다', '애매하다'와 같은 결과가 많은 상태였습니다. 이에 대해 잘못된 실험적 방법으로 발생한 것이 아닌지 확인해 볼 필요가 있으므로 선행 연구를 더 찾아보는 게 좋을 것 같다는 조언을 받을 수 있었습니다. 두 번째로 발표를 통해 연구 내용을 전달하는 방법에 대한 조언을 받았습니다. 이를 통해 앞으로의 발표회들을 준비하는 데 있어 도움을 받을 수 있었습니다.

이후의 연구 진행 상황

저희는 지금까지의 조언들과 저희가 겪은 시행착오를 바탕으로 연구 계획을 보강하였습니다. 보강한 연구 계획을 바탕으로 현재는 순조롭게 연구를 마무리해 나가고 있으며, 좋은 결과를 기대하고 있습니다.

마지막으로...

우선 저희 연구 과정 전반에 걸쳐 많은 부분을 도와주고 계신 윤덕한 선생님께 감사드립니다. 또 실험 과정 중 심화 기자재 사용을 도와주고 계신 윤나라 선생님께도 감사드립니다. 마지막으로 저희 연구를 R&E For You 웹진에 기고할 기회를 주신 김정영 연구원님께 감사드립니다.

느낀 점

인천과학예술영재학교 강진규 저는 평소 미생물에 관심이 많지 않았어요. 그래서, 생소한 주제를 접하면서 실험에 관한 이론적인 부분을 이해하는 것이 쉽지 않았어요. 하지만, 새로운 실험과 주제를 접하면서 새로운 실험 기기들을 익히게 되었고, 그 과정에서 생물학에 흥미가 생기게 되었어요. 그리고, 이번 연구를 이어 나가 식물 생장에 영향을 미치는 다른 것을 연구해 보고 싶다는 생각이 들게 되었어요. 저희 팀은 실험 대부분이 많은 양을 샘플링하고 많은 실험 과정을 거치는 실험이 많아서 팀원들 모두 고생하고, 큰 노력을 기울였던 연구였어요. 그래서인지 시간이 정말 빠르게 지나갔어요. 생물 실험이 생소한 저에게 많은 도움과 배움을 준 팀원들과 선생님께 정말 감사드리고, 기회가 된다면 다시 같이 연구를 해보고 싶어요.

인천과학예술영재학교 손동은 원래 처음 제가 지원했던 SA 분야는 화학과이었지만 추첨을 통해 생명과학과에 오게 되었습니다. 처음에는 제가 가고 싶었던 화학과가 아니라서 아쉬웠지만 지금 생각해 보면 생명과학 SA에서 한 해 동안 연구하면서 정말 다양한 것들을 배울 수 있고 스스로에게도 굉장히 도움이 많이 되었습니다. 생명과학 연구를 하며 다양한 종류의 장비들을 사용하는 방법을 배웠고, 또한 실험이 실패했을 때 이 실험을 다시 보완하여 재실험을 해보면서 실패한 실험의 원인을 분석하는 과정을 배우게 되었습니다. 그래서 올해 있었던 SA를 계기로 생명과학에 관심을 가지게 되어 나중에 제 전공인 화학과 연관시켜 대학에 가서 생화학을 공부해 보고 싶다는 목표가 생겼습니다. 또한 연구를 진행하며 팀원들끼리 협동하면서 성장할 수 있는 계기가 되었습니다.

인천과학예술영재학교 안정현 균근이라는 생소한 주제를 가지고 한 연구라서 처음에는 다른 조와 비교도 되면서 진짜 이 주제가 좋은 주제일까라는 생각을 했었는데, 이후에 계속해서 연구 활동을 하면서 주제와 연구가 구체화하면서 연구에 더 흥미가 생겼고, 계속되는 반복 작업은 힘들었지만, 이후에 결과가 나올 것을 기대하면 즐겁게 활동할 수 있었습니다. 연구 하면서 계속해서 결과가 안 나오는 일도 많았고, 어렵게 채집한 시료들을 어이없는 실수들로 버린 일도 많았지만, 오히려 그런 일들이 경험되어 다시 같은 실수를 반복하지 않게 해준다고 생각하면서 다시 즐겁게 연구 활동을 이어 나갈 수 있게 해준 것 같습니다.

인천과학예술영재학교 최윤영 제가 이번 연구를 진행하면서 가장 크게 느낀 점은 연구에는 굉장히 많은 노력이 동반된다는 점입니다. 저희 연구에서는 많은 개수의 샘플을 다루었기 때문에 샘플을 구분하기 위한 라벨링 과정에서부터 매우 많은 시간과 노력이 들어갔습니다. 또 연구 주제가 흙과 식물에 대한 내용이었기 때문에 야외에서 샘플링을 진행할 일도 많았습니다. 뜨거운 햇빛 아래에서 3시간 동안 땅을 파고 식물을 채집할 때는 팀원 모두가 정말 힘들어했습니다. 이외에도 20kg 정도의 흙을 전부 체로 거르거나, 식물 샘플 40개를 믹서기와 막자사발만으로 파우더화 하는 등 연구 과정에서 정말 많은 노력이 필요했습니다. 그래도 이러한 노력 덕분에 현재 저희 연구는 순조롭게 마무리되고 있습니다. 실험을 진행할 때는 정말 힘들었지만, 생각해 보면 이러한 노력이 모여서 좋은 결과를 만들어 낸 것 같습니다.